下呼吸道感染是一种常见的感染性疾病，严重危害人类健康。据世界卫生组织的统计，2008年全球下呼吸道感染的病死率为6.1％，居人类十大死因的第3位。下呼吸道感染的常见病原体包括细菌、病毒、支原体、衣原体及寄生虫等。研究结果显示，对病原体准确可靠的诊断是有效控制下呼吸道感染、提高治愈率和降低细菌耐药性的重要保证。但目前临床常规采用的细菌培养、病毒分离等病原学检测技术普遍存在着耗时长、敏感度差等不足，大大降低了检测效率，难以对临床抗感染治疗发挥有效的指导作用。

近年来，随着分子生物学的飞速发展，病原学诊断与分子生物学技术密切结合，形成了病原学分子诊断技术。这一新兴技术的崛起，彻底打破了传统的主要靠培养检测的局限性，并凭借其快速、准确、敏感及特异等优势在病原学诊断方面凸显作用，为下呼吸道感染的诊断、治疗及新型病原体的检出和细菌耐药机制的研究等方面提供可靠的技术支持。现将下呼吸道感染的病原学分子诊断技术的进展综述如下。

一、核酸检测

分子生物技术最早用于病原学诊断是从核酸检测开始。核酸检测技术发展至今，大致经历了核酸杂交、分离、扩增及基因芯片、PCR、DNA图谱分析及DNA测序等技术。

1。核酸杂交：最早出现的核酸杂交技术是利用生物素、放射性同位素、酶等标记的探针与样品的核酸片段进行杂交，通过检测特异的杂交信号确定病原体。该技术的特点是特异度和敏感度均高，几乎接近100％，特别是后续发展的荧光原位杂交（FISH）技术，在病原学分子诊断的早期起到了至关重要的作用。核酸杂交技术的关键在于探针的设计，目前，军团菌探针、肺炎支原体探针、EB病毒探针、呼吸道合胞病毒探针及肺孢子菌探针等已陆续问世，使下呼吸道感染的典型和非典型病原体的诊断成为可能。Edelstein等制备的cDNA探针具有军团菌属的特异性，经美国基因探针公司改进后，成为商用探针试剂盒，已被临床实验室采用。Hyman等制备的DNA探针可检出含量仅为0.1 ng的肺炎支原体DNA。Hernandez等采用核酸杂交技术成功检测到呼吸道合胞病毒。核酸杂交技术是其他核酸检测的基础，为病原学分子诊断的开展迈出了重要的一步。

2。聚合酶链反应（PCR）：自20世纪80年代问世以来，PCR技术被广泛应用于各个领域，具有划时代的意义。从最早的标准PCR，逐渐发展到多重PCR（multiplex PCR）、巢式PCR（nested PCR）、反转录PCR（RT-PCR）以及实时定量PCR（real-time quantitative PCR）等，目前PCR技术已有十几种，其扩增能力和精确性逐步提高。标准PCR主要是针对某单一基因片段进行扩增，多重PCR可同时扩增多个基因片段，而巢式PCR以及目前广泛应用的实时定量PCR在检测准确性方面则更具优势。

众所周知，对于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌以及嗜肺军团菌、肺炎支原体等非典型病原体来说，临床分离、培养难度很大，大大降低了临床检出率，而PCR技术可以弥补这一缺陷。Morozumi等采用实时定量PCR技术，从429例成人和儿童肺炎临床标本中检测到肺炎链球菌的lytA基因、军团菌的mip基因以及肺炎支原体的16S rRNA，整个检测过程仅耗时2h，且与传统的细菌培养方法相比，敏感度和特异度均大大提高。除了上述病原体外，Kawazu等还应用实时定量PCR技术在呼吸道分泌物中检测到了曲霉，突破了曲霉培养的种种限制。不仅针对细菌，PCR技术在病毒诊断方面也毫不逊色。Beckham等利用反转录PCR方法对194例合并呼吸道病毒感染的COPD患者的咽拭子样本进行了病毒检测并与常规分离和血清学检测方法进行了比较，结果发现PCR方法的病毒检出率为41.8％，而常规方法的检出率仅为23.4％，这一结果对于COPD急性发作患者的病原学快速诊断颇具意义，还可以指导用药，缩短患者住院时间。

国内对于病原体PCR诊断的研究也十分迅猛，方健等利用PCR技术可同时检测15种呼吸道病原体。2003年SARS暴发期间，研究者正是采用了实时定量PCR技术和DNA测序技术才能在短短3个月内将SARS的元凶锁定为新型冠状病毒。2009年，我国发现的新型布尼亚病毒也是应用了此项技术。

另外，PCR技术在检测细菌耐药方面也发挥了重要作用。研究结果表明，与细菌耐药相关的因子如新德里金属-β-内酰胺酶1（NDM-1）、超广谱β-内酰胺酶（ESBL）、青霉素结合蛋白2a（PBP2a）、外膜孔蛋白（OprD）等都有对应的基因片段，因而可以通过设计不同的引物来检测这些基因。Diene等采用实时定量PCR技术检测了128株菌株中NDM-1基因，显示了该技术对碳青霉烯类抗生素耐药机制研究的快速、敏感等优势。管希周等利用多重PCR技术发现了同时产AmpCβ-内酰胺酶（AmpC）和ESBL的肺炎克雷伯杆菌及其耐药表型。应用PCR技术进行耐药研究，避免了细菌分离、培养及药敏试验等繁琐的操作步骤。近年来，随着多种PCR方法联合应用以及大量商品化试剂盒的出现，该技术正日益走向成熟。

3。DNA图谱分析：除了核酸杂交、PCR等针对病原体某一特定核酸片段进行检测的技术外，还有针对病原体全基因组DNA进行检测的技术。目前常用的技术包括质粒DNA图谱分型、染色体DNA限制性内切酶分析以及DNA脉冲场凝胶电泳分型3种技术。这些技术通过采用凝胶电泳、图谱分析等方法检测病原体全基因组DNA，从而为病原体检测和分型提供了新的手段。目前，质粒DNA图谱以及DNA脉冲场凝胶电泳分型技术已应用于葡萄球菌的分型和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）耐药机制的研究。质粒图谱分型可适用于一切有质粒的病原体；DNA脉冲场凝胶电泳常作为分子生物学分型方法的“金标准”，但以上这些技术也存在着DNA图谱分析较复杂、分辨力较低及再现性较差等缺点。

4。DNA测序：对于病原体核酸不仅要了解其整体结构、片段组成，还要了解DNA碱基种类、数目以及排列等，这就需要应用DNA测序技术。1977年Sanger和Maxam分别利用双脱氧链终止法和化学降解法测定了DNA序列，此后DNA测序技术开始应用于生物、医学、法医及药学等领域。早在1985年，英国Lambden即利用该技术测定了呼吸道合胞病毒磷酸化蛋白编码的核苷酸序列，近年来，这一技术已经用于真菌、细菌、结核杆菌及弓形虫等病原体的检测，尤其在结核杆菌检测方面与核酸杂交技术相比费用明显降低。但由于测序技术对序列要求较高，因而只能检测到细菌潜在变化序列的很小一部分，因此目前该技术主要应用于病毒检测，如2007年我国温岭第一人民医院发现了导致小儿下呼吸道感染的新型病毒-Wu多瘤病毒亚洲种，并完成了测序工作。但由于DNA测序技术条件严格、仪器复杂及费用昂贵等原因，目前一般临床实验室尚无法进行，主要用于科学研究。

二、蛋白质检测

对于生物体而言，核酸和蛋白质是决定其生物学特性的重要物质，核酸是生物的遗传物质，而蛋白质则是生命活动的体现者。因此，对病原体的检测，除了针对核酸以外，还要研究其蛋白功能。随着人类基因组计划的完成，基因组学的研究重点也转移到了蛋白功能的研究，而后基因时代应运而生的蛋白质组学，也为呼吸道病原体的研究提供了一个新的平台。针对病原体蛋白质组学的检测技术主要是二维电泳和质谱或色谱分析，即将病原体的蛋白通过二维电泳转移到胶上，再经图像分析，选取特定的蛋白质斑点，经酶解和后续的质谱或色谱分析以及数据处理，确定病原体的属性，目前该技术主要用于细菌鉴定和耐药机制方面的研究。国外学者曾报道用蛋白质组学质谱技术检测了MRSA和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）的蛋白质组学，并分析比较了两者的差异，从而证实了蛋白质组学在病原诊断方面的作用。另外，Schaar等利用二维电泳和质谱分析方法发现，卡他莫拉菌的外膜囊泡具有很高的生物学活性，是运输细菌致病因子的关键结构；Soualhine等发现，肺炎链球菌突变株的磷酸盐转运蛋白与细菌耐药有关。

三、生物芯片技术

近年来，生物芯片技术得到了迅猛发展，为病原体的检测提供了新的技术平台。目前用于病原体检测的生物芯片主要包括基因芯片、蛋白芯片以及微流控芯片实验室等，这些技术凭借其微型化、高通量及自动化等优势，在微生物病原体检测、种类鉴定、功能分析诊断、基因分型、突变筛查以及基因组监测等方面正在发挥着越来越重要的作用。

基因芯片是最早用于病原体的分子生物学芯片。将代表各种病原体的特殊基因信息印制在一张基因芯片上，再经反转录过程与样品结合，即可检测出样本中有无特异病原体基因及其表达水平，由此判断感染的病原体、感染进程以及宿主反应等。目前，由于许多病原体的基因组测序工作已经完成，基因芯片技术正在逐渐应用于临床。除了基因芯片外，其他生物学芯片技术也日臻成熟，如Causse等利用DNA芯片和多重反转录PCR方法检测了呼吸道合胞病毒；2003年我国利用自主研制的全基因组芯片成功检测出了SARS病毒。同样，蛋白芯片在病原体分子诊断方面也有着广阔的发展空间，以此为平台可以检测出病原体间蛋白表达的差异，尤其对于呼吸道病毒。如杨侃等利用蛋白芯片技术检测了1022例儿童急性呼吸道感染患者的病原体，其病毒阳性检出率与ELISA法无明显差异，进而也验证了芯片技术在临床病原体检测方面的高效性和便捷性。

另外一种值得一提的是微流控芯片技术，也称芯片实验室，该技术具有高通量、高效率、低消耗及集成化等特点，在病原体核酸及蛋白检测方面的优势正日益凸显。Song等利用该技术不仅实现了细菌分选，还实现了计数和鉴定；Sun等采用微芯片平台对禽流感病毒的RNA进行了快速检测。微流控芯片技术虽然刚起步，但其在分子诊断方面将具有广阔的应用前景。

四、展望

综上所述，与传统的细菌培养等检测手段相比，分子诊断技术具有特异、敏感、快速及便捷等优势，必将在下呼吸道病原学诊断方面发挥越来越重要的作用。尽管目前这些技术尚存在假阳性、假阴性等不足，且操作复杂，成本昂贵，甚至有些技术仍处于起步和基础研究阶段，临床尚有待推广。但随着经济水平的提高和科技的不断发展，分子生物学技术在临床中的转化应用将逐渐成为临床病原学诊断的主要手段。在不久的将来，借助于分子诊断技术，通过一滴血、一滴尿以及其他体液或组织，就可在最短时间内检测出病原体，实现快速、便捷、高效的病原学分子诊断，为临床治疗提供指导，同时也将大大降低医疗费用，减轻社会的经济负担。